Sujet - Académie de Nancy-Metz

Sujet zéro
BREVET DE TECHNICIEN SUPÉRIEUR BIOTECHNOLOGIES
BIOLOGIE MOLÉCULAIRE ET GÉNIE GÉNÉTIQUE
Durée de l'épreuve : 2 heures
Coefficient : 1 Le sujet comporte 6 pages numérotées de 1/6 à 6/6 L'usage d'un dictionnaire anglais/français est autorisé L'usage de la calculatrice est interdit
Sujets zéros du BTS biotechnologies : avertissement. Les sujets zéros ont été conçus par des professeurs enseignant en BTS et
finalisés en commission de choix et d'élaboration de sujets. Contrairement
aux sujets d'examens, ils n'ont pas été testés. Leur faisabilité pendant le
temps imparti par un élève moyen n'a donc pas été vérifiée.
Il s'agit ici de montrer l'orientation et l'esprit dans lequel les sujets
peuvent valider les connaissances et savoir-faire acquis lors de la
formation des étudiants se préparant au BTS biotechnologies. Ces sujets ne
constituent pas des « modèles » ; ils donnent l'orientation des sujets
d'évaluation respectant les définitions de l'épreuve, et suivent les
préconisations qui ont guidé leur élaboration (cf « Avertissement»).
Ces sujets sont à porter à la connaissance des étudiants en formation et à
travailler avec eux à titre d'entraînement pour les épreuves terminales.
Ils nécessitent que soient conjointement mobilisées les connaissances des
élèves et leurs capacités à exploiter les documents associés.
L'industrie papetière et la lignine Obtention de végétaux transgéniques à taux réduits en lignine
La production de pâte à papier, à partir de la cellulose issue des parois
végétales, représente une industrie importante par les volumes de bois
manipulés (essentiellement le peuplier et l'eucalyptus en France et Europe
du Sud) et sa valeur économique.
Sa production nécessite la dégradation préalable de la lignine, un autre
composant majeur des parois végétales, étroitement associée à la cellulose
et dont l'extraction, coûteuse en énergie, requiert l'utilisation de
produits chimiques chlorés extrêmement polluants.
L'utilisation de végétaux possédant une lignine plus aisément extractible,
constitue donc un objectif essentiel pour l'industrie papetière afin
d'accroître ses rendements et de réduire ses efflux polluants. L'étude de différents enzymes impliqués dans la biosynthèse de la lignine,
dont une orthodiphénol-O-Méthyl Transférases (OMT), a montré que la
réduction de leur activité, dans des mutants naturels, pouvait entraîner
une modification de la structure et de la composition de ce polymère dans
ces végétaux. Plusieurs entreprises de biotechnologies ont entrepris de cloner et
d'étudier le gène de cet enzyme pour les espèces forestières, afin de
pouvoir modifier son activité et de l'introduire dans des plantes
transgéniques adaptées à l'industrie papetière.
Il s'agit : - de cloner le gène équivalent à celui de l'OMT de Tabac et présent
chez l'eucalyptus,
- d'étudier son expression et la régulation associée,
- d'élaborer une construction qui permette l'élaboration de plantes
transgéniques,
- d'analyser les plantes transgéniques obtenues. 1. Clonage du gène d'OMT d'Eucalyptus (6,5 points). Le gène d'OMT de Tabac est connu et sa séquence a été identifiée. La
démarche choisie pour cloner le(s) gène(s) d'OMT d'Eucalyptus consiste à
obtenir tout d'abord un ADN complémentaire (ADNc) puis de rechercher la
séquence du gène complet à l'aide d'une banque génomique d'Eucalyptus. 1.1 Obtention d'un clone d'ADNc d'OMT d'Eucalyptus par RT-PCR.
1.1.1 Donner la définition d'un ADNc. 1.1.2 À l'aide d'un schéma légendé, présenter les étapes qui
permettent, dans une cellule eucaryote, de passer d'une
séquence d'ADN à l'ARN messager mature correspondant.
Mentionner les différentes étapes, leurs caractéristiques et
préciser leur localisation cellulaire.
La technique choisie par les laboratoires consiste à essayer de cloner le
gène d'OMT d'Eucalyptus en réalisant une RT-PCR à partir d'ARN totaux
extraits de feuilles d'eucalyptus (document 1) et d'amorces déduites des
séquences d'OMT connues du Tabac.
1.1.3 À partir du document 1, élaborer un organigramme
présentant les étapes de cette RT-PCR. 1.1.4 Justifier le choix de l'amorce antisens utilisée dans la
première réaction. 1.2 Réalisation d'une PCR nichée (nested PCR). Une seconde PCR, dite « nichée », est ensuite réalisée en utilisant
comme ADN matrice les amplicons purifiés de l'expérience 1 et de
nouvelles amorces, également dérivées des séquences du Tabac, mais
plus internes à la séquence du gène que les précédentes (leur
position est visualisée sur le document 2). 1.2.1 Préciser quel est l'intérêt de réaliser cette seconde PCR. Les amorces utilisables pour cette deuxième PCR sont présentées dans
le document 2. 1.2.2 À l'aide de la formule de Wallace Tm = 4 n(G+C) + 2
n(A+T), calculer les Tm de chacune des amorces. 1.2.3 Choisir le(s) meilleur(s) couple(s) d'amorces
utilisable(s) en justifiant brièvement la réponse. 1.2.4 Déterminer la température d'hybridation des amorces
choisies. Justifier la réponse.
2. Expression de la séquence OMT d'Eucalyptus (5 points). Le fragment obtenu en 1.2 a été séquencé. Cette séquence nucléotidique a
été comparée aux séquences disponibles dans les bases de données en
réalisant un BLAST (Basic Local Alignement Sequences Tool).
Cette séquence a ensuite été introduite dans un vecteur d'expression (pTAC)
(document 3). 2.1 Donner le principe d'un BLAST et indiquer les paramètres
permettant d'apprécier la qualité du résultat. 2.2 Présenter, à l'aide de schémas, l'étape d'élongation de la
traduction de cet ARN messager (l'enzyme est cytosolique). 2.3 Indiquer le milieu à utiliser pour sélectionner les bactéries
transformées par ce vecteur. 2.4 Expliquer comment l'expérimentateur peut reconnaître les clones
bactériens possédant le vecteur recombiné contenant l'insert d'OMT.
Justifier précisément la réponse.
3. Élaboration d'eucalyptus transgéniques dont l'activité OMT est
modifiée (3,5 points). La stratégie adoptée pour essayer de réduire l'activité OMT est une
stratégie d'inactivation de gènes, appelée « stratégie antisens ». La
première étape consiste en l'obtention, par la méthode d'agro-infection,
d'eucalyptus transgéniques contenant un ADN OMTmodifié. 3.1 Rappeler les particularités du métabolisme de la bactérie
Agrobacterium tumefaciens. 3.2 À l'aide d'un schéma légendé, présenter la structure du plasmide
caractéristique de cette bactérie et les éléments moléculaires
essentiels au transfert d'ADN.
Des fragments de feuilles d'Eucalyptus lacérées, sont mis en
présence d'une culture d'Agrobactéries transformées par le plasmide
recombinant pAeOMT (document 4). La sélection et le développement
des plantules transgéniques sont alors réalisés.
3.3 Le vecteur pAeOMT est qualifié de « binaire ». Justifier cette
appellation.
3.4 Préciser le rôle des éléments numérotés sur l'ADN-T de ce
plasmide.
4. Analyse des eucalyptus transgéniques (3 points). 4.1 Donner la définition d'une plante transgénique. Dans la « stratégie antisens » réalisée ici, on espère que la séquence
OMT insérée en orientation antisens conduira à un « transcrit antisens »
qui provoquera la réduction de l'expression du gène OMT endogène et donc
une diminution de l'activité OMT correspondante dans les plantes
transgéniques.
Le document 5 montre les résultats obtenus pour un échantillon de trois
types de plantes transgéniques. L'activité GUS a également été mesurée
dans ces plantes. 2. Analyser les résultats de l'activité OMT pour ces différentes
plantes. 3. Proposer une explication de la variabilité de l'activité OMT dans
ces plantes. 4. Préciser l'intérêt d'évaluer l'activité GUS. 5. Analyser les résultats de l'activité GUS. 6. Conclure quant aux plantes les plus intéressantes pour l'industrie
papetière. Clarté et rigueur de l'expression écrite de la composition (2 points)
Document 1 : RT-PCR reaction with total eucalyptus RNA. For first-strand cDNA synthesis, 10 µg of total eucalyptus RNA was heated
at 65°C for 3 min, cooled on ice, and incubated in 50 µL of 50 mM Tris-HCl,
pH 8.3, containing 75 mM KCl, 1 mM DTT, 15 mM MgCl2, and 1 mM of each dNTP
in the presence of 40 pmol of an oligo(dT) primer (called antisense
primer). After the addition of 20 U of AMV reverse transcriptase, the
reaction mixture was incubated at 42°C for 2 hours. After the mixture was
heated for 5 min at 95°C, the DNA was precipitated, washed with 70% ethanol
and dissolved in 50 µL of sterile distilled water.
For amplification of cDNA, the PCR reaction was performed in 100 µL of
buffer containing 50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl, pH 8,3, 5 mM MgCl2, 200 µM of
each dNTP and 0,8 µM sense N1 (see its sequence herafter) and oligo(dT)
primers. After 5 min of denaturation at 94°C, the solution was cooled and 5
U of Taq polymerase was added. Thirty