Ronéo - Free

TP1 bactériologie
Mardi 14 octobre 2008
14h-17h
Ronéotypeuse : Elsa Darvish
Démarche diagnostique. Démarche qualité. Diagnostic bactériologique des
infections urinaires.
1 Plan du cours : I. Démarche diagnostique bactériologique directe. 1. Le prélèvement.
2. L'examen bactériologique à J0.
3. L'examen bactériologique à J1 et J2.
4. Retour des résultats au clinicien.
5. Diagnostic indirect.
II. Infection cutanée à Staphylococcus aureus.
III. Observations au microscope/ Cultures.
IV. Diagnostic bactériologique d'une infection urinaire. La prof de la salle115 du mardi après-midi nous a dit que les autres
groupes ne feraient pas exactement les mêmes choses que nous, même si
globalement c'est le même sujet. En gros, ce sont les mêmes choses que dans
les autres groupes mais dites autrement, avec des exemples un peu
différents. Pour notre groupe, elle a précisé qu'il y aurait 2 questions au
contrôle de la semaine prochaine : une portant sur le staphylocoque et
l'autre sur les infections urinaires...à vous de lui faire confiance ou
pas.
Je vous conseille aussi d'aller voir les diapos correspondant au cours sur
le site des D1 : dcem1p7.free.fr
Et dans le poly, les pages se rapportant au cours sont : pages 9, 22, 29,
35-36, 42-43. Bon courage à tous... 2
I. Démarche diagnostique bactériologique directe. Diagnostic direct : Mise en évidence de la bactérie elle-même ; diagnostic
de certitude. 1. Le prélèvement. - Le prélèvement varie selon le siège de l'infection :
> Pour le diagnostic d'une méningite, on utilisera : Ponction lombaire
(LCR)+ hémoculture (sang).
> Pour la diarrhée : Coproculture (selles).
> Pour l'infection urinaire : ECBU.
> Pour la pneumonie : Expectoration ou prélèvement bronchique ou
hémoculture.
- On fait le prélèvement avec du matériel stérile à usage unique (récipient
stérile ou écouvillon) en respectant les règles d'asepsie élémentaire :
toute contamination du produit peut entraîner des erreurs
d'interprétation (inhibition de la bactérie pathogène que l'on recherche
par d'autres bactéries, nouvelles bactéries qui ne faisaient pas partie
du prélèvement,...) .
Il y a sur nos muqueuses et notre peau un grand nombre d'espèces
bactériennes qui nécessitent d'être éliminées avant de faire un prélèvement
(pour faire le prélèvement il faut d'abord désinfecter +++). - Le prélèvement doit être fait précocement et avant toute antibiothérapie
(de préférence) . En effet, à cause de l'antibiotique, on pourra croire à
tort qu'il n'y a pas d'infection, car la bactérie ne réussira pas à se
multiplier dans la culture de gélose à cause de l'antibiotique qu'elle
aura reçu auparavant. - Le prélèvement doit être apporté le plus rapidement possible au
laboratoire (ensemencement rapide), car certaines bactéries ne résistent
pas ou se multiplient. Par exemple, certaines bactéries sont inhibées par
l'exposition à l'air prolongé. La température peut également jouer sur la
multiplication des bactéries. 2. L'examen bactériologique à J0.
A. Etude macroscopique du prélèvement. L'aspect est très important. Par exemple, si on reçoit le LCR d'une
ponction lombaire, si le liquide est claire il y a beaucoup moins de
probabilité que le patient ait une méningite que si le liquide est trouble.
En effet, l'observation d'un trouble du liquide céphalo-rachidien laisse
entendre qu'il s'agira probablement d'un certain type d'infection.
Il y a 4 éléments importants qu'il faut utiliser lors de l'observation
macroscopique du prélèvement :
> Trouble : urine, LCR, liquide pleural ou articulaire.
> Hématurique : urine, LCR, liquide ou autre coloration anormale pleurale
ou articulaire.
> Odeur : On notera celle caractéristique lors d'infections à germes
anaérobies strictes dans un liquide pleural.
> Consistance : Exemple d'une selle diarrhéique.
B. Etude microscopique du prélèvement. Le microscope permet d'observer des bactéries totalement invisibles à l'?il
nu (par exemple le streptocoque a un diamètre de 20 microns).
Le grossissement de référence est x1000 (une bactérie de 1 microns sera vue
comme faisant 1mm). > Examen microscopique à l'état frais : c'est un examen microscopique qui
se fait entre lame et lamelle d'une goutte de prélèvement (urine,
LCR,...) et on fait une observation dans une petite logette de 1mm3 (on
appelle ça le compte en cellules de Malassez). On peut numérer les
cellules qui correspondent à une réaction inflammatoire
(polynucléaires,...) et les hématies. On peut également repérer s'il y a
des bactéries dans notre prélèvement, grâce à leur réfringence, mais
aussi grâce à leur mobilité.
> Coloration de Gram (à partir d'un frottis) : microscope optique à
immersion (x100). C'est une coloration basée sur la perméabilité de la
paroi des bactéries à l'alcool.
-1er temps : cristal violet + lugol. C'est un complexe colorant soluble
dans l'alcool qui colore en violet le cytoplasme de toutes les
bactéries.
-2ème temps : décoloration par l'alcool. L'alcool traverse la paroi des
bactéries dites à Gram négatif et dissout le complexe colorant(bactéries
décolorées). Pour les bactéries à Gram positif, la paroi ne se laisse
pas traverser par l'alcool(les bactéries Gram+ restent donc colorées en
violet).
-3ème temps : contre-coloration par de la fuschine (rose). Les bactéries
décolorées apparaissent en rose (ce sont les Gram négatif).
(Attention, la coloration de Gram ne permet pas une identification mais
une orientation).
Donc : Les bactéries Gram positif sont violettes et les bactéries Gram
négatif sont roses.
Les bactéries peuvent être caractérisées par leur forme (cocci qui sont
rondes, bacilles qui sont des formes longues, cocobacille,
fusiforme,...), par leur groupement (amas, chaînettes, diplocoques), et
leur Gram + ou -. Cela est très utile car orient l'antibiothérapie.
Ex : Pus à l'intérieur duquel on trouve des coccis à Gram positif en
amas (staphylocoques).
> Autres colorations : (certaines bactéries ne se colorent pas avec la
coloration de Gram). On a aussi des colorations spécifiques, comme par
exemple celle de Ziehl-Neelsen, qui permet de mettre en évidence les
mycobactéries (agent de la tuberculose) et qui colore des bacilles acido-
alcoolo-résistants.
C) Autres méthodes utilisées.
> Immunologie : Cette technique consiste à caractériser l'antigène du
produit patholoqique.
Ex : Détection de l'antigène soluble pneumococcique dans le LCR (test
rapide : 30 minutes).
On imprègne un écouvillon de LCR de l'échantillon. Puis on met en
contact cet écouvillon qui contient la bactérie et son antigène avec un
anticorps spécifique de l'antigène recherché. Au bout d'un quart d'heure
de contact entre le produit pathologique et la membrane revêtue
d'anticorps, on a une réaction qui se manifeste sous forme de lignes de
précipitation qui correspondent à la présence de l'antigène qu'on
recherche.
Autre exemple : recherche de toxine C.Difficile.
> Méthodes moléculaires : Les techniques de biologie moléculaire arrivent
de plus en plus dans les laboratoires spécialisés. Elles sont très
intéressantes pour mettre en évidence divers produits pathologiques.
PCR : l'amplification génique d'un ADN cible.
Application de ces méthodes moléculaires :
-Bactéries non cultivables.
-Bactéries de culture lente et difficile.
-Détection rapide en urgence d'un pathogène.
-Amélioration de délai diagnostic (mycobactéries).
D) La mise en culture du prélèvement. Le prélèvement est ensemencé sur différents milieux choisis en fonction du
pathogène recherché :
> Milieux simples.
> Milieux enrichis (utilisés pour les bactéries exigeantes).
> Milieux sélectifs (si bactérie à isoler au sein d'une flore commensale).
L'isolement des bactéries : Il se fait par une technique appelée
l'isolement en cadran : Sur un milieu solide, on dépose une goutte de
prélèvement (par exemple de la gorge, où il y a plein de streptocoques) que
l'on étale en stries fine avec un instrument stérile, pour étaler les
bactéries. On étale d'abord la goutte sur la moitié de la boîte (cadrans 1
et 2) puis on disperse ce qu'il y a sur le 1er cadran, sur le 3ème cadran
(on est sensé avoir une densité de colonie moins importante dans ce 3ème
cadran) ....Le but est d'obtenir des colonies isolées, car s'il y a
plusieurs espèces bactériennes, car pour faire l'antibiogramme, il faut une
seule espèce de bactérie, on peut ainsi étudier la bactérie isolée, ce qui
est plus simple.
Puis étuve à 37°C. De plus, certaines bactéries nécessitent des milieux
particuliers (aérobie, anaérobie, atmosphère enrichie en CO2).
En général, les colonies se multiplient et donnent une colonie visible au
bout de 18 à 24h, mais pour certaines bactéries le délai doit être
prolongé. s
3. L'examen bactériologique à J1 et J2 : J1 (à J5) : comme on vient de le voir, l'isolement sur milieu solide permet
d'obtenir des colonies séparées. On fait alors une lecture des milieux de
culture. A) Identification d'un pathogène :
L'interprétation d'une culture positive se fait en fonction du site de
prélèvement et du contexte clinique.
Responsabilité du bactériologiste :
-Distinguer un pathogène au sein d'une flore.
-Incriminer une bactérie dite commensale comme responsable de l'infection
(terrain particulier).
-Quantification d'un pathogène (ex : urines). B) Identification de la bactérie responsable de l'infection :
Orientation diagnostic : Il y a plusieurs étapes pour identifier une
bactérie :
> Coloration de Gram sur une ou des colonies : on regarde alors la forme,
les groupements, la coloration, + ou - présence d'une capsule ou non, de
spores,...
> Aspect des colon