Fiche technique n°2 microbiologie :

Examen MICROSCOPIQUE :
À L'ETAT FRAIS
( But : Il permet l'étude microscopique des bactéries vivantes, en l'absence de
toute fixation ou coloration. Cette méthode permet d'observer : - la MORPHOLOGIE des bactéries
- le MODE de GROUPEMENT
- la MOBILITE
- la DENSITE ou PROPORTION de chaque microorganisme en cas de
mélange ( Matériel nécessaire : - lames
- lamelles
- microscope photonique : objectif x 10 et x 40 ( Technique : En microbiologie, une préparation à l'état frais consiste à enfermer entre
lame et lamelle une suspension de micro-organismes vivants.
L'ancienne technique du lutage est actuellement abandonnée (sauf exception
lors de l'étude des bactéries anaérobie strictes). Il convient donc de
réaliser une préparation correcte (sans déborder) afin de limiter la
diffusion des micro-organismes dans l'environnement du laboratoire. 1. Prélèvement : . A partir d'une culture liquide : Prélever un aliquote de suspension à
l'anse (ou à la pipette stérile) . A partir d'un milieu solide : réaliser une suspension en eau
physiologique à partir d'une culture jeune et prélever un aliquote de
suspension à l'anse de platine (ou à la pipette stérile) . A partir de produits alimentaires ou biologiques : selon le cas l'examen
sera direct ou nécessitera une dilution (milieu solide) ou une
concentration (urines) 2. Dépôt de la goutte de suspension sur la lame : la lame doit être propre et sèche
3. Dépôt de la lamelle : Déposer délicatement une la lamelle selon la technique décrite ci-dessous :
4. Si la préparation est incorrecte, modifier comme ci-dessous : 5. Mise au point : . Repérer la bordure d'une bulle d'air à l'objectif x10.
. Faire la mise au point en faible luminosité ( condensateur baissé et
diaphragme légèrement fermé) objectif x40.
. Attendre 1 minute pour ne pas confondre une mobilité positive et un
simple mouvements liquidiens
. L'observation ne doit pas excéder 3 minutes (bactéries sensibles à la
chaleur)
. Eliminer les lames dans le bac de 3 en 1 6. Observations : . Rechercher la motilité des bactéries aérobies à partir d'Etat Frais en
bordure d'une bulle d'air.
. Rechercher la motilité des bactéries anaérobies strictes à partir de
préparations lutées ( voir page 209 du dictionnaire des techniques N°1 )
Une bactérie MOBILE doit se déplacer dans le champ microscopique avec un
mouvement qui lui est propre, les autres bactéries restant immobiles. Les bactéries mobiles peuvent laisser deviner leurs ciliatures :
- un déplacement rapide linéaire : ciliature susceptible d'être
polaire
- un déplacement lent, circulaire et sinueux : ciliature susceptible
d'être péritriche |[pic] | |
| |[pic] | . Présentation des résultats d'observation : |ETAT FRAIS objectif x 40 (grossissement 400) |
|FORME |MOBILITE |GROUPEMENT |DENSITE |
| | | | |
|Bacilles ou |- ou + vraisemblablement |Paire ou Isolé ou |Evaluation de |
|coque |péritriche ou polaire selon |Chaînettes ou amas |la proportion |
| |le cas | |de chaque |
| |et préciser la vitalité | |germe dans un |
| | | |mélange | 7. Causes d'erreur : . Mobilité faussement négative :
- nature du milieu : milieux sélectifs, milieux trop secs, milieux
trop âgés
- température de croissance : en fonction de l'espèce
- rapport avec l'O2 : bactérie mobile aérobie observée dans une
préparation sans air (ou inversement pour les anaérobies)
- fautes techniques : observations trop tardives, utilisation
d'instruments non refroidis... . Mobilité faussement positive :
- mouvements transmis par les courants du liquide, qui entraînent
toutes les bactéries dans le même sens.
- mouvements browniens : mouvements désordonnés autour d'un axe, sans
déplacement véritable.
- mouvements pendulaires : mouvements de certaines espèces, prenant
comme axe une de leurs extrémités (Shigella) ce n'est pas une
motilité ;
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Préparation correcte.
Le liquide est bien réparti Préparation incorrecte.
Recommencer Présence de beaucoup de bulle d'air.
Elles ne doivent pas apparaître sur le champ montrer. laisser tomber la lamelle lorsque la goutte adhère à la lamelle avancer la lamelle vers la préparation