LE DIAGNOSTIC BACTERIOLOGIQUE

LE DIAGNOSTIC BACTERIOLOGIQUE Dans le diagnostic des maladies infectieuses la methode bacteriologique
joue un role essentiel. L'examen bacteriologique consiste a examiner de divers prelevements sur des
milieux de culture afin d'obtenir des souches (cultures) pures qui sont
identifiees, testees vis-a-vis des antibiotiques, eventuellement
conservees.
Le deroulement de l'examen bacteriologique se decompose en un ensemble
d'etapes successives qui va du prelevement des echantillons biologiques
jusqu'a la remise des resultats. Chacune d'entre ces etapes apporte au
diagnostic des elements qui seront pris en compte pour l'elaboration du
resultat final. La phase pre-analytique comprend plusieurs etapes dont la sequence et la
coordination doivent etre sans faille. Prescription medicale La prescription medicale est un acte de reflexion intellectuelle qui repond
a un objectif diagnostique, prognostique, therapeutique ou preventif. Il
doit y avoir coherence entre l'ordonnance, les rensegnements cliniques et
les prelevements. Elle intervient apres interrogatoire et l'examen clinique
du patient et la consultation eventuelle des autres examens biologiques
deja pratiques. Le prescripteur porte la responsabilite de l'indication de
l'analyse bacteriologique, il assume la responsabilite du prelevement et du
transport.
L'analyse bacteriologique doit etre prescrite explicitement sur
l'ordonnance. Le prescripteur, son nom, sa qualite doivent etre clairement
identifies, de meme que l'identite du malade, le but de l'analyse, la
nature des principales manifestations pathologiques et leur date
d'apparition et localisation. Peuvent etre important a notifier: un etat
d'immunodepression, la prise d'antibiotiques, la grossesse, le voyage
recent, etc. Execution du prelevement Le prelevement est un acte-cle de la phase pre-analytique. Le choix du ou
des echantillons, de leurs modalites de prelevement, de transport et de
conservation doivent etre de qualite optimale, a defaut de quoi, les
resultats des analyses risquent de n'avoir aucune utilite clinique (mieux
vaut renoncer a un examen que transmettre un prelevement inadequat ou de
mauvaise qualite).
Le ou les prelevements sont effectues par le prescripteur (medecin), le
bacteriologiste ou une personne deleguee (infirmier, interne) selon la
reglamentation en vigueur.
Le preleveur doit respecter les regles d'hygiene et les precautions
standard, notamment en ce qui concerne le port de gants, blouses, etc. Le
materiel destine a entrer en contact avec le patient doit etre sterile et a
l'usage unique.
Le prelevement doit etre realise le plus pres possible du debut des
manifestations cliniques est avant la prise d'un antibiotique.
. Sites des prelevements, modalites et delais de transport
De facon generale, toute lesion accessible doit etre prelevee. Il est
souvent utile de prelever differents sites, correspondant a la porte
d'entree habituelle du microbe, aux tissus cibles dans lesquels la bacterie
se multiplie et a sa voie d'elimination. Le plus souvent on examine les
secretions nasales et rhinopharingees, les selles, les urines, les liquides
de lavage broncho-alveolaire, le liquide cephalorachidien, le contenu des
vesicules et ulcerations cutaneo-muqueuses, le pus, le sang, les fragments
des tissus (pieces de biopsie ou d'autopsie), etc.
Des elements du milieu environnant peuvent etre egalement examines: l'eau,
l'air, les aliments etc.
Le prelevement doit etre en quantite suffisante pour que les recherches
soient possibles.
Le recipient destine a recevoir le prelevement doit etre sterile, adapte a
la nature du prelevement et des analyses, afin d'eviter tout risque de
contamination et de pollution.
Le recipient est transporte dans un sac en plastique ou dans une boite
metalique etanche et ferme hermetiquement, comportant un compartiment
separe pour les documents qui l'accompagnent.
Le preleveur est responsable d'etiqueter les recipients contenants
l'echantillon biologique. Il faut mentionner l'identite, la date de
naissance, le sexe du patient, ainsi que la nature de l'echantillon, la
date et meme l'heure du prelevement.
Concernant le delai de transport, le diagnostic bacteriologique necessite
un transport sans delai au laboratoire, ou un conditionnement specifique
(milieu de transport, congelation, etc.). En effet, le delai lie au
transport, ainsi que les mauvaises conditions dans lesquelles le
prelevement est achemine peuvent alterer qualitativement et
quantitativement les constituants des echantillons biologiques.
L'EXAMEN BACTERIOLOGIQUE PROPREMENT DIT
Tout d'abord, le prelevement recu est soumis a l'examen macroscopique qui
permettra de noter une modification de l'aspect, de l'odeur, orientant deja
le diagnostic. Ensuite, le prelevement doit etre prepare pour
l'investigation (centrifuge, disperse, homogenise, etc.). Apres il est
soumis a l'examen microscopique. On prepare des frottis, on les colore par
Gram, Ziehl-Neelsen, Aujeszky, Hinss, etc. (selon les besoins). L'examen
cytologique permet de denombrer les elements cellulaires et les identifier,
d'apprecier la presence des bacteries, leur abondance, leur caracteristique
de Gram, la mise en evidence d'une acidoresistance, d'une capsule, etc. Les
donnes de cet examen sont prises en compte dans le choix des milieux de
culture utilises lors de la partie bacteriologique.
I ETAPE: Isolement de la culture pure
Isoler des bacteries consiste a obtenir une clone (culture pure) a partir
d'un melange de cellules bacteriennes ou d'un produit pathologique. Chaque
colonie, si elle est suffisamment eloignee de ses voisines, constitue une
culture pure.
Pour l'isolement des cultures pures on utilise des milieux solides coules
en boites de Petri. A la base de l'isolement des bacteries sont les
techniques d'epuisement de l'inoculum (ensemencement en stries,
ensemencement en quadrant, etalement consecutivement sur trois boites).
Apres l'ensemencement les boites seront mises a incuber pendant 18 a 24
heures, a 37(C. Lors de l'incubation chaque cellule isolee (de toute espece
capable de croitre sur le milieu) donnera naissance a une colonie
distincte. II ETAPE: Accumulation de la culture pure
Toutes les colonies sont soumises a un examen macroscopique (on remarque la
taille, la forme, la couleur, la consistence, etc.) afin de choisir les
colonies suspectes. Une fois selectees, il faut s'assurer que dans chaqune
des colonies selectionnees, toutes les cellules sont de la meme espece. Il
est toujours possible qu'une colonie - meme bien isolee - contienne des
cellules de deux especes differentes. Ceci peut arriver si, au cours de la
striation, deux cellules differentes se sont deposees (par hasard) au meme
endroit a la surface de la gelose. Pour lever ce doute, on prepare un
frottis colore par Gram. Pour obtenir une biomasse suffisante pour
l'identification de cette culture, on repique chaque colonie. Le repiquage
bacterien consiste a transferer les cellules d'une culture ou d'une colonie
donnee dans un milieu sterile frais (d'habitude une gelose en pente). Pour
repiquer une colonie donnee on touche legerement sa surface avec une boucle
sterile. Une petite quantite de cellules de la colonie adhere ainsi a la
boucle et peut etre deposee par striation sur la pente de gelose. On met
les tubes ensemences a incuber a 37( C pendant 18 a 24 heures. La
descendance de toutes cellules formera une couche continue de bacteries,
qui couvrira toute la surface du milieu (croissance confluente). III ETAPE: Identification de la culture pure
L'identification consiste a mettre en evidence quelques caracteres
importants qui permettront de ranger le germe isole dans une famille,
genre, espece determines. Habituellement on determine de certains
caracteres de la bacterie isolee, apres on les compare aux caracteres de
nombreuses especes connues jusqu'a trouver une similitude. On determinera
souvent en premier lieu les caracteres suivants, parce qu'ils offrent la
plus grande valeur distinctive, chacun d'entre eux permettant d'exclure un
ou plusieurs des principaux groupes bacteriens:
1. Caracteres morfologiques du germe: forme, groupement, mobilite, type de
ciliature, spore, capsule...;
2. Reaction aux colorants (proprietes tinctoriales), particulierement la
coloration de Gram;
3. Caracteres de culture: rapport avec l'oxygene, exigences nutritives,
aspect des colonies, pigmentation, hemolyse, etc.;
4. Proprietes biochimiques qui consistent a definir l'equipement
enzymatique de la bacterie (metabolisme glucidique, lipidique,
proteique);
5. Sensibilite aux antibiotiques;
6. Si pour certaines bacteries l'identification s'arrete a ce stade, pour
d'autres il est important de preciser les constituants antigeniques au
moyen de serums specifiques (tests serologiques);
7. Eventuellement le pouvoir pathogene experimental sera recherche par
inoculation a l'animal, mettant alors en evidence la virulence de la
souche ou ses caracteres toxigenes.
8. Dans un contexte epidemiologique particulier, il peut etre utile de
pousser l'identification de la souche jusqu'au stade du lysotype
(sensibilite vis-a-vis des bacteriophages). Etude du metabolisme glucidique. Dans certains genres bacteriens, on peut
distinguer les especes l'une de l'autre d'apres les types d'hydrates de
carbone qu'elles sont capables de metaboliser. La gamme des sucres qu'un
microorganisme donne utilise peut se determiner simpl