Typage d'un individu (l'empreinte génétique ou « test ADN)

Typage d'un individu (l'empreinte génétique ou « test ADN »)
Chaque être humain se distingue de ses " semblables " par un ensemble de
caractéristiques morphologiques et biologiques qui rendent son
identification possible.
Les techniques utilisées pour mettre en évidence le polymorphisme de l'ADN
permettent aujourd'hui d'obtenir, dans de courts délais, des résultats
extrêmement précis à partir d'échantillons ne contenant qu'une quantité
infime de produit biologique. Elles imposent, en contrepartie, des
précautions rigoureuses pour parer aux risques de contamination qui
compromettraient la fiabilité des analyses. les chances de voir deux
individus non apparentés présenter le même profil sont de l'ordre d'une sur
un milliard. La mise en oeuvre des investigations sur un tel ensemble de
loci permet par ailleurs de fournir des réponses dans un délai inférieur à
48 heures).
Pour la recherche en paternité, un seul allèle étant pris en compte,
l'analyse du polymorphisme des individus concernés s'opère habituellement à
partir de treize marqueurs. En l'absence d'exclusion dans chacun de ces
systèmes, la probabilité de paternité est calculée à l'aide d'un programme
qui tient compte, là encore, de la fréquence de chaque marqueur génétique
dans la population de référence.
1. Polymorphismes utilisables 1.1 Le polymorphisme de l'ADN nucléaire Pour 4 à 5 %, la molécule d'ADN est constituée par les gènes qui sont le
support de l'information. Ces unités codantes se retrouvent au niveau de
l'ARN messager lors du phénomène de transcription puis se traduisent en
protéines.En revanche, la plus grande partie (95 à 96 %) de l'ADN nucléaire
ne commande directement aucune synthèse protéique et l'on ignore
actuellement sa fonction précise. Dans cette partie non codante, l'analyse
a mis en évidence des régions variables : il s'agit de segments d'ADN
caractérisés par la répétition en tandem d'unités de base composées de deux
ou plusieurs nucléotides. La taille de ces fragments, ou allèles, varie en
fonction du nombre de répétitions. On distingue ainsi deux types de
polymorphisme :
a. les mini-satellites ou VNTR (Variable Numbers of Tandem Repeats)
correspondent à des motifs répétées en tandem, de 15 à 40 paires de bases.
Le nombre de ces répétitions est variable d'un individu à l'autre,
constituant une série allélique. Des études récentes considèrent que nous
aurions 1 500 zones de ce type, soit 1 500 systèmes de polymorphisme.
b. les micro-satellites ou STR (Short Tandem Repeats), unités répétitives
dont le motif est très court (4 paires de bases en moyenne) et répété de
deux à dix fois ou plus. Des centaines de microsatellites ont été étudiés
mais, peuvent seuls être retenus pour la pratique des empreintes génétiques
ceux
* qui sont aisément amplifiables avec une expression simple des allèles,
* présentent un fort taux d'hétérozygotie
* expriment un nombre d'allèles suffisamment élevé.
Deux points importants doivent être soulignés à propos de cet examen des
zones variables :
* plus nombreux sont les sites polymorphes qui font apparaître une
concordance entre un échantillon recueilli sur le lieu d'une infraction et
un échantillon connu (prélevé sur un suspect), moins il est probable que
l'échantillon provienne d'un individu différent.
* La non concordance constatée sur un seul site polymorphe conduit à
écarter de façon absolue l'individu dont le profil ADN est confronté à
celui de l'échantillon recueilli.
La certitude de l'identification s'apprécie en termes de probabilité,
l'exclusion en termes de certitude. 1.2. Le polymorphisme de l'ADN mitochondrial L'ADN mitochondrial (ADNmt), présent dans le cytoplasme, peut également
être utilisé pour l'expertise génétique : il s'agit d'une petite molécule
circulaire et monocaténaire de 16 569 paires de bases qui code pour des
chaînes polypeptidiques nécessaires au fonctionnement de la mitochondrie et
pour des ARN. Sa séquence est entièrement connue et elle présente deux
régions hyper variables. Le polymorphisme n'est pas lié ici à des
variations de longueur mais à des variations dans la composition en
nucléotides (polymorphisme de structure).
Une autre caractéristique de l'ADNmt est son hérédité maternelle. En effet,
l'ovule est bien fourni en mitochondries (entre 100 000 et 200 000) alors
que le spermatozoïde n'en contient qu'un petit nombre qui ne persistent pas
dans la descendance. La mère transmet donc son ADNmt à tous ses enfants
mais seules les filles le transmettront à leur tour à leur progéniture.
Par ailleurs, le polymorphisme de l'ADNmt est moins marqué que celui de
l'ADN nucléaire et l'analyse qui en est faite est donc moins discriminante.
Il présente néanmoins un double intérêt :
* préservé par la haute résistance de la mitochondrie et présent à de
nombreux exemplaires dans une cellule (de l'ordre de 50 génomes
mitochondriaux pour un seul génome nucléaire), il peut être analysé sur des
traces anciennes ou fortement dégradées sur lesquelles l'ADN nucléaire
n'est plus exploitable. La recherche historique en a fait ces dernières
années un fréquent usage, notamment pour les ossements de la famille
impériale de Russie et pour le coeur présumé de Louis XVII conservé à St
Denis.
* il peut également permettre d'expertiser des tissus biologiques dépourvus
d'ADN nucléaire, mais riches en mitochondries, qui sont prélevés sur une
scène de crime. C'est notamment le cas des tiges de cheveux. 2. Techniques 2.1. Analyse par hybridation
Technique utilisée dès 1985 avec des sondes multilocus puis des sondes
monolocus. L'ADN est tout d'abord digéré par une enzyme de restriction , ce
qui génère de l'ordre d'un million de fragments tous différents. Ces
fragments sont triés par ordre de taille par électrophorèse sur gel
d'agarose, puis transférés par Southern Blot sur membrane de nylon où l'on
peut les hybrider avec différents types de sondes. 2.2. Sondes multilocus Dès 1985 on a utilisé des sondes oligonucléotidiques pouvant reconnaître
plusieurs sites dont les séquences d'ADN sont très voisines sur l'ensemble
du génome, il est possible, en les rendant radioactives, de faire
apparaître les fragments hybridés sur une autoradiographie. Le
polymorphisme de taille, différent chez chaque individu, se traduit par la
mise en évidence de bandes noires ressemblant à un code-barre dont il faut
définir avec précision la taille des fragments. Ces sondes peu spécifiques
ont été appelées multilocus. [pic]
Figure 8- 24. Empreinte génétique de 5 personnes établie avec une sonde
multilocus. Malgré son très fort pouvoir discriminant, cette méthode a été abandonnée
car elle présentait, pour la médecine légale, un certain nombre
d'inconvénients. 2.3. Sondes monolocus
En 1989, cette méthode fut améliorée par l'usage de sondes monolocus qui
utilisent, comme les précédentes, la technique du Southern Blot et étudient
le même type de variabilité mais se concentrent sur une seule localisation
du génome. L'autoradiographie ne révèle donc qu'un locus représenté par un
ou deux allèles selon que le sujet est homozygote ou hétérozygote. Il est
possible d'augmenter la puissance de ce test en multipliant les sondes
spécifiques.
[pic]
Figure 8-25.Utilisation de sondes monolocus pour confirmer une filiation. Cette technologie robuste est peu sensible aux contaminations, très
discriminante et d'une interprétation aisée. Elle présente d'autre part
l'avantage de permettre un travail sur les mélanges d'ADN, mais elle
demeure coûteuse en temps et en personnel et sa faible sensibilité requiert
une quantité importante (500 ng au minimum) d'ADN non dégradé et bien
purifié. Si elle reste encore employée, dans le domaine civil, pour les
recherches de paternité, elle a été supplantée au pénal par la réaction de
polymérase en chaîne (PCR) basée sur l'amplification génique. 2.4. Analyse par PCR L'amplification génique est plus facile à réaliser sur des unités
répétitives du génome dont le motif n'est composée que de deux à sept
nucléotides, les micro-satellites ou STR (Short Tandem Repeats), qui seront
localisés sur différents chromosomes et exprimeront un nombre d'allèles
suffisamment élevé.
Le nombre de loci étudiés doit être assez élevé pour conférer à l'analyse
du profil génétique un pouvoir réellement discriminant. Tous les
laboratoires français utilisent aujourd'hui des kits qui incluent une
quinzaine de régions du génome sélectionnées par le système américain CODIS
pour leur haute valeur discriminante
Cette technique présente de nombreux avantages qui expliquent qu'elle se
soit imposée dans tous les laboratoires spécialisés pour l'établissement
des profils génétiques :
* Une réaction PCR peut être réalisée sur une très faible quantité d'ADN
représentant cinquante à cent cellules, qu'il soit dégradé ou non, purifié
ou non, récent ou ancien et, pratiquement, quel que soit le support. Ceci
permet d'obtenir des résultats à partir de très petits échantillons et de
pratiquer un complément d'expertise avec le matériel restant.
* La méthode est facile à pratiquer, les réactifs pouvant être fournis sous
forme de kits prêts à l'emploi.
* Le recours à l'informatique permet d'obtenir le résultat de l'analyse
dans un délai très court, avantage décisif dans le cadre d'une enquête
judiciaire : douze heures pour une trace de sang, soixante douze heures
pour une trace de sperme. Dans le cas d'un prélèvement buccal opéré sur un
suspect, ce délai n'excède pas six heures et est donc compatible avec celui
de la garde à vue.
La seule faiblesse de cette méthode, liée à sa très grande sensibilité,
réside dans le risque de contamination par un ADN étranger, et ce d'autant
plus que la quantité d'ADN analysable est réduite. Des précautions
draconiennes doivent donc être observées tant au stade du recueil des
échantillons qu'à celui de l'analyse.
Toutes les méthodes ci-dessus, qui utilisent des STR, sont applicables à
l'ADN nucléaire. 2.5 L'analyse de l'ADN mitochondrial La définition du mitotype (type de l'ADNmt) porte sur la détermination
d'envir