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Section 3
CHROMATOGRAPHIE
7. Un bref historique Mikhail Semenovich Tsvet (ou Michael Tswett) en 1903 fut le premier
à réaliser par cette technique la séparation de pigments végétaux sur une
colonne, un réservoir cylindrique, remplie de particules de carbonate de
calcium (figure 3.1). Il fallut attendre par la suite plusieurs années pour
un développement substantiel de la chromatographie, développement initié
principalement par les travaux de Martin et Synge, en 1941. Ces chercheurs
ont découvert que le passage d'un mélange d'acides aminés acétylés au
niveau d'une colonne remplie de gel de silice provoquait leur séparation.
Ensuite sont nées les techniques de chromatographie en phase gazeuse, sur
papier et en couche mince et finalement, la chromatographie HPLC (de
l'anglais «High Performance Liquid Chromatography») vers la fin des années
1960. Cette dernière a produit un effet pour le moins explosif dans le
monde scientifique, si bien qu'elle connaît aujourd'hui des applications
dans tous les secteurs où les sciences comme la chimie et la biologie sont
présentes, notamment au niveau de l'industrie pharmaceutique, clinique et
alimentaire, l'industrie des polymères et le secteur de la protection de
l'environnement. Figure 3.1. Colonne chromatographique |1848 |Way et Thompson: ont découvert le |
| |phénomène d'échange ionique en solides |
|1850-1900 |Runge, Schönbein, et Goeppelsroeder: |
| |ont étudies l'analyse capillaire sur le|
| |papier. |
|1876 |Lemberg: a démontre la réversibilité et|
| |la st?chiométrie de l'échange ionique |
| |dans le silicate d'aluminium |
|1892 |Reed: a réalise la premier séparation |
| |sur colonne: un tube remplis a caolin |
| |fut utilise pour séparer un mélange de |
| |FeCI3 et CuSO4 |
|1903-1906 |Tswett : a réalise la séparation d'un |
| |mélange des pigments naturels sur une |
| |colonne remplie a alumine. Fut le |
| |premier qui a proposer l'utilisation du|
| |solvant en chromatographie. |
|1930-1932 |Karrer, Kuhn et Strain: ont réalises |
| |des séparations sur le charbon active, |
| |sur l'alumine et sur le magnésite |
|1935 |Holmes et Adams: ont réalises la |
| |synthèse des résines organiques- |
| |échangeurs d'ions |
|1938 |Reichstein: a développe la |
| |chromatographie liquide |
|1938 |Izmailov et Schreiber:ont effectue la |
| |séparation sur les couches minces |
| |d'alumina |
|1939 |Brown: la mise en place de la |
| |chromatographie circulaire sur le |
| |papier |
|1940-1943 |Tiselius: Devised frontal analysis and |
| |method of displacement development. |
|1941 |Martin et Synge: ont développe la |
| |chromatographie de partition sur |
| |colonne |
|1944 |Consden, Gordon, et Martin: la premier |
| |description de la chromatographie de |
| |partition sur papier |
|1947-1950 |Boyd, Tompkins, Spedding, Riemann, ont|
| |appliqué l'échange ionique pour divers |
| |problèmes analytiques |
|1948 |M. Lederer et Linstead:Application de |
| |la chromatographie sur papier pour la |
| |separation des composes inorganiques |
|1951 |Kirchner: Introduction en |
| |chromatographie en couche mince des |
| |principes actuels |
|1952 |James et Martin: ont developpes la |
| |chromatographie gazeuse |
|1956 |Sober et Peterson: ont prépares |
| |l'échangeur ionique de cellulose |
|1956 |Lathe et Ruthven: ont utilises l'amidon|
| |naturel et modifie pour séparer les |
| |corps d'après leur poids moléculaire | 7.1 Définition de la chromatographie La chromatographie regroupe un ensemble de techniques dont l'objet est
de réaliser la séparation des différentes composantes d'un mélange. La séparation est possible grâce aux différences d'affinité que
possèdent les composés pour une phase mobile et une phase stationnaire.
Dans le contexte de la chromatographie, le terme «phase» ne réfère ni à une
période de temps, ni à un état physique tels les états solides, liquides ou
gazeux. Il réfère, dans l'expression «phase stationnaire», à un support, à
un matériau, où les molécules à séparer sont retenues. La phase
stationnaire est fixe et possède une surface considérable pour permettre de
lier une grande quantité de matériel. Plus une molécule possède d'affinité
pour la phase stationnaire, plus elle s'y accroche fermement, quel que soit
le mécanisme de cette rétention sélective. La «phase mobile» réfère quand à
elle à un fluide en déplacement. Il peut s'agir d'un liquide ou d'un gaz.
Elle se déplace à la surface d'une mince couche de phase stationnaire ou à
travers de multiples particules de phase stationnaire entassées dans une
colonne, entraînant avec clic, et tous à peu près à la même vitesse, les
composés non retenus à la phase stationnaire.
La chromatographie est essentiellement une technique de séparation
physique dont le champ d'application en analyse quantitative est restreint
aux situations où la composition du mélange à séparer est connue. Pour
identifier des composés séparés par chromatographie, lorsqu'on ignore tout
de leur structure chimique, il est fréquent de coupler à la séparation
comme telle, une technique d'analyse complémentaire comme par exemple la
spectrométrie de masse ou la spectroscopie infrarouge. Nous verrons les
principes de ces deux techniques au module suivant. 7.2 Classification des techniques de chromatographie Les techniques de chromatographie peuvent être subdivisées en plusieurs
classes selon un certain nombre de critères. Les plus communs sont: ( la forme physique de la phase stationnaire,
( le mode d'alimentation de l'échantillon,
( l'état physique des phases et leur polarité et finalement, le mécanisme
par lequel la séparation entre
( les différents composés s'effectuent. 7.2.1 La forme physique de la phase stationnaire La phase stationnaire, ou le support de chromatographie, peut se
présenter sous l'aspect d'une surface plane comme c'est le cas en
chromatographie sur couche mince (ou en chromatographie sur papier). La
phase stationnaire, sous forme de particules de faible taille, peut aussi
être entassée à l'intérieur d'un tube. Dans ce dernier cas, il s'agit de
chromatographie sur colonne. Sous forme de particules, la phase
stationnaire offre une surface importante où les échanges moléculaires sont
permis en grand nombre. Aussi, la phase stationnaire peut être immobilisée
sous la forme d'une couche mince sur la paroi d'un long tube de diamètre
interne très petit d'où son nom de colonne capillaire. La phase mobile
circule au centre du capillaire et les échanges se font à sa périphérie.
Aujourd'hui, en chromatographie en phase gazeuse, les colonnes capillaires
supplantent largement, en popularité, les colonnes remplies. La figure 3.2
illustre les trois formes physiques des phases stationnaires, soit une
plaque de chromatographie sur couche mince, une colonne remplie et une
colonne capillaire.
[pic]
Figure 3.2. Forme physique des phases stationnaires en chromatographie
7.2.2 Le mode d'alimentation de l'échantillon En chromatographie frontale, la phase stationnaire est continuellement
alimentée par l'échantillon provoquant le déplacement des composés en
fonction de leur affinité pour le support. Cette technique est à peu près
disparue aujourd'hui où la plupart des techniques de chromatographie sur
colonne sont des techniques d'élution. Au niveau de ces techniques,
l'échantillon est déposé au sommet de la colonne, en couche très mince et
sous des conditions qui favorisent une forte interaction entre la majorité
des molécules et le support stationnaire. Une phase mobile de composition
uniforme ou variable entraîne par la suite l'élution séquentielle des
différents composés. 7.2.3 L'état physique des phases La distinction entre la chromatographie liquide et la chromatographie
en phase gazeuse repose sur la nature de la phase mobile. En
chromatographie liquide, la phase mobile est liquide alors qu'en
chromatographie en phase gazeuse, c'est un gaz qui transporte avec lui
toutes les molécules non retenues à la phase stationnaire. Un second niveau
de classification est aussi fréquemment utilisé. Par exemple, il est
possible de distinguer la chromatographie liquide-solide de la
chromatographie liquide-liquide. Dans le premier cas, la phase stationnaire
est solide et la phase mobile est liquide alors qu'en chromatographie
liquide liquide, les deux phases sont liquides. L'une d'elle est
immobilisée au niveau d'un support solide stationnaire par adsorption ou
par l'intermédiaire d'un lien covalent (phase liée), l'autre se déplace.
Sur le même principe, il est possible de distinguer la chromatographie gaz-
solide de la chromatographie gaz-liquide. 7.2.4 La polarité des phases Diverses molécules plus ou moins polaires selon leur structure chimique
composent les différentes phases stationnaires et mobiles utilisables en
chromatographi