les plantes transgeniques - Université Paris-Sud

LES PLANTES TRANSGENIQUES : BIOREACTEURS POUR LA PRODUCTION DES PROTEINES RECOMBINANTES A USAGES THERAPEUTIQUE ET BIOPHARMACEUTIQUE
Dr NATO AIME
Institut de Génétique et Microbiologie UMR UPS/CNRS 8621 Bât. 360
Université Paris Sud XI
91405 ORSAY Cedex France
Tél. : 01 69 15 46 93 Email : aime.nato@igmors.u-psud.fr
PLAN DU COURS LA TRANSGENESE VEGETALE : PRINCIPES ET
APPLICATIONS ASPECTS FONDAMENTAUX DE LA PRODUCTION DES PROTEINES HETEROLOGUES CHEZ LES
PLANTES - Avantages des cellules végétales par rapport aux cellules animales et aux
micro-organismes AGRICULTURE MOLECULAIRE VEGETALE
- Aspects génétiques de l'agriculture moléculaire chez les plantes - Modifications post-traductionnelles et purification de la protéine
recombinante - Les techniques de l'Agriculture Moléculaire EXEMPLES DE PRODUCTION DE MOLECULES BIOACTIVES PAR LES PLANTES
TRANSGENIQUES
CONCLUSIONS PERSPECTIVES DANS L'INDUSTRIE PHARMACEUTIQUE BIBLIOGRAPHIE COMPAGNIES OU PLATEFORMES DE BIOTECHNOLOGIES IMPLIQUES DANS LES DOMAINES DE
PRODUCTIONS BIOPHARMACEUTIQUES. LA TRANSGENESE VEGETALE : PRINCIPES-APPLICATIONS Les plantes génétiquement modifiées (OGM) sont surtout connues du public
pour l'introduction de nouveaux caractères d'intérêt agronomique dans des
variétés cultivées. Il s'agit de résistances à des herbicides, à des
parasites, une composition modifiée en protéines ou lipides, une stérilité
mâle, ou encore du transfert des gènes impliqués dans la tolérance aux
conditions environnementales comme la sécheresse, le froid, le stress
oxydatif, la salinité du sol, les attaques par les insectes, les virus.... Actuellement,outre ces applications à l'amélioration des plantes, la
transgenèse intéresse les industries biopharmaceutiques, qui voient dans
les cellules végétales et les plantes de nouvelles usines, autotrophes pour
le carbone, capables de produire des protéines et des molécules
hétérologues ou recombinantes à forte valeur ajoutée. Le succès de la transgenèse végétale suppose de satisfaire à la fois
plusieurs exigences : pénétration de l'ADN étranger dans les cellules
végétales, intégration dans le génome végétal, aptitude du ou des
transgènes à s'exprimer, possibilité de sélectionner grâce à la présence et
l'expression d'un gène de résistance à un antibiotique comme la kanamycine
et aptitude à obtenir la régénération de plantes entières à partir des
tissus ou des cellules végétales. Cette étape exige la maîtrise des
techniques de la culture in vitro via la multiplication végétative, grâce à
l'exploitation de la totipotence des cellules somatiques végétales, même
après une modification dans leur génome. La technique de transfert d'ADN la plus employée est celle qui utilise la
capacité naturelle de la bactérie du sol, Agrobacterium, à transférer une
région définie d'ADN dans le génome nucléaire des cellules végétales.
Ces bactéries (A. tumefaciens et A. rhizogenes) sont responsables de
l'apparition, sur de nombreuses espèces végétales, de la galle du collet
(crown gall) et du syndrome de chevelu racinaire (hairy roots). On sait
depuis 1974 que des substances particulières (les opines) sont synthétisées
par les tumeurs ou les racines induites, et que cette transformation des
cellules végétales est l'?uvre des plasmides présents dans les souches
virulentes d'Agrobacterium. Ces plasmides sont appelés Ti (pour Tumor
inducing) et Ri (pour Root inducing).
En 1977, on montrait que la transformation des cellules végétales par
Agrobacterium tumefaciens résultait de l'intégration dans leur génome d'un
fragment d'ADN (ADN-T pour ADN transféré) issu des plasmides Ti.
Les mécanismes moléculaires à la base de ces phénomènes naturels de
transformation génétique s'apparentent finalement à une conjugaison
bactérienne dont le partenaire receveur serait une cellule végétale. Les
gènes portés par les ADN-T ne s'expriment pas dans Agrobacterium mais
seulement dans le noyau des cellules végétales. Pour obtenir des plantes
transgéniques, on utilise le fait qu'il est possible de supprimer les
oncogènes de l'ADN-T, ce qui a pour effet de désarmer la bactérie, c'est-à-
dire de lui ôter tout caractère pathogène, tout en conservant la
possibilité d'obtenir le transfert de gènes choisis depuis la bactérie vers
le noyau de la cellule végétale. [pic] [pic]
Le remplacement de l'ADN-T par un gène d'intérêt
[pic] En plus de la transformation via Agrobacterium, d'autres techniques de
transfert d'ADN sont utilisées:des procédés chimiques, physiques sur des
tissus ou des cellules végétales, par éléctroporation avec des protoplastes
isolés. Dans tous les cas, si l'ADN atteint le noyau et s'il s'exprime, il
est possible d'obtenir la synthèse de la protéine codée par les gènes qu'il
renferme. Il faut aussi que la construction génétique renferme un ou des
signaux, en particulier les signaux dits promoteurs, qui stimulent la
transcription dans la cellule hôte. Ensuite les ARN messagers sont reconnus
par les ribosomes, chargés de traduire ce message en protéines d'intérêt.
Les protéines, une fois traduites, sont alors adressées et véhiculées vers
le compartiment cellulaire dans lequel elles doivent fonctionner.
|Etapes de la transgenèse |Outils et techniques associés |
|Repérer un caractère | |
|intéressant dans un organisme | |
|vivant : (plante, champignon, | |
|bactérie...). |Cartographie du génome |
|Examen du génome |Séquençage |
| | |
|Identifier la protéine | |
|responsable de ce caractère (ex| |
|: protéine toxique pour un | |
|insecte ravageur). | |
|Identifier et isoler le gène |Enzyme de restriction. |
|d'intérêt Obtention d'un |Southern blot |
|mélange de fragments d'ADN. | |
|Identification d'un gène dans | |
|un mélange de fragments. | |
|Réaliser et amplifier une | |
|construction génique | |
|Insertion d'un fragment d'ADN |Construction génique |
|dans un plasmide |Clonage d'un gène. |
|Introduction du plasmide | |
|modifié dans le génome de la | |
|cellule hôte. | |
|Transférer de l'ADN | |
|Introduction d'un ADN étranger |Vecteurs biologiques |
|ou remplacement d'un fragment |(bactéries, virus) |
|d'ADN |Recombinaison homologue |
| |Fusion utilisant des liposomes |
| | |
| |Transfection |
| |Utilisation du polyéthylène |
| |glycol (PEG) |
| |Micro-injection in vitro |
| |Electroporation |
| |Canon à particules |
|Contrôler l'efficacité du |Hybridation in situ |
|transfert chez l'hôte |PCR |
|Par détection directe des | |
|transgènes | |
|Sélectionner des cellules |Gène de sélection |
|exprimant le gène ajouté |Gènes rapporteurs |
|Par tri | | [pic]
Les grandes étapes du développement des plantes transgéniques
1973 : Identification du plasmide Ti dans la bactérie Agrobacterium
tumefaciens. Ce plasmide permet d'accueillir le transgène porteur du
caractère d'intérêt, qu'il est en mesure d'introduire dans le génome de la
plante. 1983 : Première plante transgénique obtenue (tabac au stade expérimental). 1985 : Première plante transgénique résistante à un insecte. 1987 : Première plante transgénique tolérante à un herbicide total. 1988 : Première céréale transgénique (maïs résistant à la kanamycine). 1990 : Première commercialisation d'une plante transgénique : tabac
résistant à un virus (Chine). 1994 : Premier légume transgénique commercialisé (tomate à maturation
retardée). 1997 : Premier tabac producteur d'hémoglobine. En France : première
autorisation de la culture transgénique pour un maïs résistant à la pyrale.
1999 : 40 millions d'hectares de plantes transgéniques dans le monde. 2000 : Séquençage du génome d'Arabidopsis thaliana. 2002 : 58,7 millions d'hectares de plantes transgéniques cultivées dans le
monde 2005 : près de 90 millions d'hectares de plantes transgéniques dans les
pays tels que les Etats-Unis, la Chine, l'Inde, l'Argentine ......
ASPECTS FONDAMENTAUX DE LA PRODUCTION DES PROTEINES HETEROLOGUES PAR LES
PLANTES
Aujourd'hui, on envisage l'usage des plantes entières, des organes et des
cellules isolées transformés comme usines à produire des molécules, des
protéines à for