Mai n°195.doc - Inra

|[pic] |[pic] | Mai 2002 n°195 Une version plus complète de ce bulletin est accessible sur le site de
l'INRA www.inra.fr. sous son nom dans : Information Scientifique et
Technique puis Publications INRA en ligne.
Le signe ### dans cette version papier indique quelques développements
supplémentaires ou des commentaires additionnels consultables dans la
version électronique. André BERKALOFF
e-mail : andre.berkaloff@igmors.u-psud.fr Concepts et Techniques
1. Un article vengeur de Phil Green (Proceedings of the National Academy
of Sciences USA 99 (02APR02) 4143-4144) affirme, en s'appuyant sur celui de
RH Waterston, ES Lander et JE Sulston; Proceedings of the National Academy
of Sciences USA 99 (19MAR02) 3712-3716 (les acteurs du projet public de
séquençage du génome humain), que la séquence du génome humain publiée par
Celera n'est pas aussi "whole genome shotgun" que cela, car elle emprunte
largement à la séquence publique pour boucher une multitude de "trous"
irréductibles.
Les deux techniques comportent une phase shotgun sur des segments
génomiques au hasard, puis un réassemblage utilisant les recouvrements en
évitant de tomber dans le piège des séquences répétées. On effectue ensuite
de nouveaux séquençages, quand il y a un doute, et pour boucher les trous.
Des séquençages shotgun à 6-8 reprises d'un même segment sont usuellement
utilisés pour limiter la phase de raffinement qui coûte cher.
Dans l'entreprise publique internationale de séquençage "clone par clone",
ce sont des blocs d'à peu près 150 000 pb qui ont été, au préalable, clonés
dans des chromosomes bactériens artificiels et séquencés, chacun, par la
méthode shotgun (shotgun hiérarchique). La méthode à l'avantage de
minimiser les erreurs d'assemblage, car on sait d'où les séquences, de
l'ordre de 600 à 800 pb, viennent. Le coût de la phase cartographie des
clones est de 10% du total, celui du shotgun consécutif est de 50-60% (pour
une couverture de 5-6 fois) et celui de la finition est de 30-40%.
Celera a choisi la voix d'un shotgun généralisé, sans clonage préalable de
grands fragments, suivi d'un réassemblage global informatisé. Cette
technique n'est pas nouvelle dans la mesure, où c'est celle qui a été
utilisée pour les protéines depuis 50 ans.
Cela a relativement bien marché pour la drosophile, mais avec environ 2
500 trous. L'examen de la séquence du génome humain montre que les
revendications de Celera sont très surfaites. En effet, la séquence
"publique" a été découpée et utilisée pour rétablir l'ordre des
innombrables fragments obtenus par shotgun, ce que l'informatique n'avait,
apparemment, pas réussi à faire. La séquence des BACs a été, par ailleurs,
utilisée pour combler les lacunes des séquences de la méthode shotgun,
etc...
La concordance des deux séquences, utilisée par Celera pour vanter sa
prouesse n'est donc que très normale, et ne prouverait rien, puisque la
séquence de Celera a utilisé directement celle du projet public. On ne sait
donc pas ce que la technique peut valoir à cette échelle.
Il reste que, même dans ces conditions, 20% de la séquence manque ou est
présente sous forme de 116 000 microséquences (de 2,3 kb en moyenne) non
placées. Il semble bien que la rapidité du séquençage est plus liée à la
multiplicité des machines capillaires crachant 500 à 1000 séquences,
chacune, par jour, qu'à la technique shotgun par elle-même. Ce qui le
montre, c'est que dès que le consortium public a pu disposer du même nombre
de séquenceurs capillaires, sa cadence a atteint et même dépassé celle de
Celera avec la technique clone par clone.
Dans le cas de la drosophile, au génome plus compact, Celera a dû
séquencer une quinzaine de fois le génome pour pallier les lacunes du
shotgun global, ce qui a doublé les frais du shotgun considéré comme plus
économique. De toute façon il a fallu recourir aux séquences à partir de
clones pour raffiner la séquence.
L'auteur affirme, enfin, qu'au lieu d'inciter à un travail plus efficace,
cette course a été néfaste, car elle a encouragé des raccourcis risqués. La
compétition a eu également des effets pervers dans l'entreprise "publique".
En effet, l'analyse des BACS a été parfois bâclée pour gagner du temps. Par
ailleurs, il ne paraît pas évident que la décision de publier une ébauche
de séquence de qualité intermédiaire ait été judicieuse (voir les séquences
des riz dans "Les Productions Végétales"). L'ardeur des séquenceurs s'est
émoussée à partir de là, et la finition risque d'être plus longue que
prévue (on le saura dès l'an prochain, date fixée antérieurement).L'auteur
ne met pas en cause la compétition, mais souligne que le financement privé
de Celera a faussé le jeu en suscitant des désinformations et des
surenchères injustifiées. Pour Waterston et al., l'analyse des données
publiées par Celera n'exclut pas la possibilité de séquencer par shotgun
global de gros génomes comme ceux de mammifères, mais ne le démontre
nullement.
( (( (( (( (( (
3. Le numéro de Février de Current Opinion in Biotechnology est
traditionnellement consacré aux techniques, ici d'exploitation de l'ébauche
du génome humain et plus généralement des différentes "X-omiques".
B Schweitzer et al.; p.14-19 commentent les avancées récentes dans le
domaine des réseaux de protéines, en soulignant ce qui reste encore à
améliorer sérieusement avant d'en tirer tous les bénéfices. TJ Phelps et
al.; p.20-24, se concentrent sur l'utilisation des microréseaux pour
l'analyse des modifications métaboliques et phénotypiques entraînées par
des fluctuations du milieu.
Ce sont surtout les mutations intervenant dans des voies métaboliques
connues dont les effets sont analysés. Le suivi des métabolites est obtenu
par des technologies à réponse rapide comme la spectrométrie de masse TOF
(Time of Flight) sous ses différents aspects et la RMN. On obtient ainsi
des carte des fluxs métaboliques. Les facteurs du milieu qui ont été
utilisés sont la fluctuation des donneurs d'électrons, des agents
stressants et, notamment, de la température.
L'utilisation du 13C des lipides microbiens pour l'étude du métabolisme
géochimique est analysée par CL Zhang p.25-30. La composition d'un
consortium anaérobie d'archées associées à des bactéries réduisant le
soufre a ainsi pu être analysé. Une telle étude est intéressante pour le
devenir des hydrates de méthane
Parmi les capteurs et interrupteurs biologiques, le cas de ribozymes
allostériques qui permettent d'obtenir des basculeurs ne fonctionnant qu'en
présence d'une molécule spécifique allant d'oligonucléotides à des
protéines, est traité par RR Breaker; p.31-39. D'autres ligands sont
possibles.
WCW Chan et al.; p.40-46, analysent les nouvelles techniques permettant la
production des "quantum dots". Elles utilisent des nanocristaux de métaux
ou de semi conducteurs de 2 à 6 nm qui ont la particularité d'avoir des
propriétés physiques dépendant de leur taille et d'être, par ailleurs,
d'une taille voisine des macromolécules biologiques (voir le §100). Les
recherches récentes de plusieurs groupes ont portés sur de telles
particules liées à diverses macromolécules (peptides, protéines ou ADN).
Ceci permet d'inventer des mesures en milieu homogène, ou de créer des
marqueurs fluorescents multicolores jouant sur la taille des particules
pour la couleur, par exemple, et permettant des analyses multiplex. Je n'ai
pas tout compris, mais cela me semble passionnant. .
DP Allison et al.; p.47-51 décrivent les applications du microscope à
force atomique qui permet de mesurer des couples de l'ordre du piconewton,
qui correspondent aux forces maintenant les structures des macromolécules.
On utilise un microcantilever en nitrure de silicium pour mesurer les
forces présentes. L'utilisation des anticorps permet d'ajouter une
dimension à ce type d'études. On trouvera également, dans ce numéro, des
mises au point sur l'amplification de génomes complets, l'identification
des protéines parmi leurs isomères, et l'utilisation de diverses techniques
informatiques pour l'analyse des masses de données qui nous submergent.
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4. L'ARN polymérase II (RNAP II) ne peut assurer la transcription
qu'associée à de nombreux co-facteurs, et à laquelle le complexe Mediator
transmet les éléments nécessaires à la régulation. On distingue les
facteurs généraux de transcription (GTFs) qui sont exigés pour une
initiation précise de la transcription par RNAP II.
La stimulation de la transcription en réponse à des activateurs
spécifiques d'un promoteur donné fait intervenir divers co-facteurs.
Mediator en fait partie. Découvert il y a deux ans, c'est le plus
universel. Les sous-unités de ce complexe interagissent individuellement et
directement avec plusieurs protéines régulatrices.
Une revue sur l'architecture ce complexe fondamental est parue dans
NA Woychik et al.; Cell 108 (22FEB02) 453-463.
RNAP II comporte 12 sous-unités très fortement conservées, de la levure
aux mammifères. Son architecture est maintenant connue à l'échelle
atomique, ce qui permet d'envisager une analyse fine de son fonctionnement.
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5. La recombinase Cre du bactériophage P1 a largement été utilisée pour
des clivages sites spécifiques d'acides nucléiques. Biologiquement, son
rôle est de cliv