Sujet - Académie de Nancy-Metz

Sujet zéro BREVET DE TECHNICIEN SUPÉRIEUR BIOTECHNOLOGIES BIOLOGIE STRUCTURALE ET FONCTIONNELLE DES PROTÉINES Durée de l'épreuve : 2 heures
Coefficient : 1
Le sujet comporte 7 pages numérotées de 1/7 à 7/7
L'usage d'un dictionnaire anglais/français est autorisé
L'usage de la calculatrice est interdit
Sujets zéros du BTS biotechnologies : avertissement.
Les sujets zéros ont été conçus par des professeurs enseignant en BTS et
finalisés en commission de choix et d'élaboration de sujets. Contrairement
aux sujets d'examens, ils n'ont pas été testés. Leur faisabilité pendant le
temps imparti par un élève moyen n'a donc pas été vérifiée. Il s'agit ici de montrer l'orientation et l'esprit dans lequel les sujets
peuvent valider les connaissances et savoir-faire acquis lors de la
formation des étudiants se préparant au BTS biotechnologies. Ces sujets ne
constituent pas des « modèles » ; ils donnent l'orientation des sujets
d'évaluation respectant les définitions de l'épreuve, et suivent les
préconisations qui ont guidé leur élaboration. (cf : «Avertissement »)
Ces sujets sont à porter à la connaissance des étudiants en formation et à
travailler avec eux à titre d'entraînement pour les épreuves terminales.
Ils nécessitent que soient conjointement mobilisées les connaissances des
élèves et leurs capacités à exploiter les documents associés.
Caractérisation de la métallocarboxypeptidase
de l'archaebactérie hyperthermophile Pyrococcus furiosus Les métallocarboxypeptidases (EC 3.4.17) sont des carboxypeptidases à
cation métallique divalent présent dans le site actif. Elles possèdent une
courte séquence conservée comprenant deux histidines et un acide
glutamique. 1. Structure et purification de l'enzyme (8,5 points) 1.1 Représenter la structure plane de l'un (au choix) de ces deux acides
aminés. 1.2 Présenter la structure chimique de la liaison peptidique entre deux
acides aminés en montrant la configuration et les liaisons autorisant
une libre rotation.
Une métallocarboxypeptidase (dénommée PfuCP) a été purifiée à partir de
l'archaebactérie Pyrococcus furiosus.
Le document n° 1 présente les étapes de la purification et les résultats
obtenus.
1.3 Analyser globalement les résultats présentés par l'électrophorégramme
du document n° 1. Préciser les informations obtenues sur la pureté
d'une part et sur la structure d'autre part.
1.4 Montrer que le facteur d'enrichissement lors de l'étape (C) est très
voisin de 3.
1.5 À partir des données du tableau, calculer le rendement global de la
purification. Cette valeur est-elle surprenante ?
La structure de la PfuCP a été déterminée par diffraction aux rayons X.
Elle se caractérise par la présence d'un nombre important d'hélices alpha
et une structuration en domaines. 1.6 Indiquer comment sont stabilisées les hélices alpha des protéines
(aucun schéma n'est exigé). Préciser si tous les acides aminés sont
compatibles avec cette structure secondaire. 1.7 Rappeler ce qu'on entend par domaine protéique.
La masse moléculaire de la PfuCP a été évaluée par chromatographie
d'exclusion-diffusion en conditions natives. La valeur déterminée est
alors d'environ 120 kDa. 1.8 Présenter le principe de la chromatographie de gel filtration
(exclusion-diffusion) en précisant la signification de « zone de
perméation sélective » (zone de diffusion partielle).
Expliquer précisément comment cette technique peut permettre
d'évaluer la masse moléculaire d'une protéine. 1.9 En combinant les résultats obtenus par l'analyse SDS-page et
l'analyse en chromatographie d'exclusion, donner la structure
probable de la PfuCP. Justifier la réponse. 2. Caractéristiques cinétiques de l'enzyme (6 points) Les caractéristiques cinétiques de la PfuCP ont été étudiées. Les résultats
sont présentés dans le document n° 2. Les mesures de vitesse ont été
réalisées en méthode « 2 points » avec arrêt de la réaction (temps zéro
puis temps 10 minutes). Les vitesses obtenues ont été utilisées comme des
vitesses initiales (vi) pour tracer un graphe vi=f([ZAR]) et 1/vi=1/[ZAR]
où [ZAR] désigne la concentration en substrat. 2.1 Indiquer comment est arrêtée la réaction. 2.2 Expliciter précisément la notion de vitesse initiale en enzymologie.
La réponse devra faire intervenir les notions d'état stationnaire et
d'état pré-stationnaire de réaction. 2.3 Expliquer pourquoi le comportement de la PfuCP est qualifié de
michaélien.
Définir le KM.
Donner la valeur du KM de la PfuCP pour le substrat ZAR. 2.4 Le document n° 3 décrit une étude de l'influence de la température
sur l'activité de l'enzyme et les résultats obtenus.
- Justifier l'allure affine de la fonction
ln(vitesse)=f(1/température absolue).
- Expliquer l'écart à la loi d'Arrhénius pour les températures
testées les plus élevées.
- Calculer l'énergie d'activation de la réaction. Pour le calcul on
admettra que R, constante des gaz parfaits, a pour valeur 8 JK-1mol-
1.
Donnée : rappel de la loi d'Arrhénius pour un coefficient de vitesse
k,
k = A e -Ea/RT où A désigne le coefficient pré-exponentiel
qui peut être considéré comme constant, Ea l'énergie
d'activation, T la température absolue en K et R la constante
des gaz parfaits. 3. L'enzyme, outil de séquençage (3,5points) Comme l'activité carboxypeptidase de la PfuCP est récurrente, son
utilisation pour le séquençage de peptides est possible. Un peptide N-
acétylé, la N-acétyl-rénine est soumis à digestion ménagée par la PfuCp à
la température de 80°C pendant 1 minute puis le résultat de l'hydrolyse est
analysé par spectrométrie de masse MALDI-TOF. Les résultats sont présentés
dans le document n° 4. 3.1 Le pic correspondant à la masse moléculaire 1801,1 est celui de la N-
acétyl-rénine intacte. Montrer qu'on peut expliquer le pic 1714,1 par
la présence d'une sérine en position C-terminale. Justifier
l'utilisation de la masse moléculaire de l'eau dans le calcul
nécessaire. 3.2 Justifier le caractère ménagé de l'hydrolyse réalisée et expliquer
comment se manifeste sur le graphe du document n° 4 l'action
récurrente de la PfuCP. 3.3 En déduire la séquence des 7 derniers acides aminés de la N-acétyl-
rénine.
On peut envisager d'utiliser de la PfuCP immobilisée sur billes
magnétiques pour les opérations de séquençage. 3.4 Quel serait l'intérêt de cette immobilisation ? 3.5 Proposer (sans développer) une méthode d'immobilisation utilisable
dans ce cas. Clarté et rigueur de l'expression écrite de la composition (2 points) Document n° 1
Purification de la PfuCP et analyse des extraits Après culture en fermenteur, les bactéries sont recueillies par
centrifugation du moût. Les bactéries sont alors lysées. Le lysat est
centrifugé, le surnageant est recueilli et constitue l'extrait brut utilisé
pour la suite des étapes de la purification (il est protégé à l'aide de
l'inhibiteur PMSF de certaines protéases).
Après chaque étape de purification on réserve la fraction contenant le
maximum d'enzyme. On mesure la concentration en protéines totales et la
concentration en activité catalytique de la fraction réservée, ce qui
permet de calculer la quantité totales de protéines et la quantité d'enzyme
récupérée. Puis on passe à l'étape de purification suivante. |Référenc|Étapes de la purification |Protéines|Quantité d'enzyme|
|e de | |totales |récupérée en |
|l'étape | |(mg) |unités U |
|A |Extrait brut |20 000 |150 103 |
|B |Chromatographie sur échangeur fort d'anions|2398 |100 103 |
|C |Chromatographie d'adsorption sur |802 |100 103 |
| |hydroxyapatite | | |
|D |Chromatographie d'interaction hydrophobe |183 |83 103 |
| |(motif butyl) | | |
|E |Chromatographie sur échangeur fort d'anions|14 |16 103 |
|F |Chromatographie d'exclusion diffusion |13 |16 103 |
|G |Chromatographie sur échangeur fort d'anions|10 |15 103 |
Tableau. Purification de la métallocarboxypeptidase de l'archaebactérie
hyperthermophile Pyrococcus furiosus (PfuCP). Les différentes étapes
successives sont indiquées par la colonne de gauche du tableau. Par
convention, une unité d'enzyme catalyse l'hydrolyse de 1 µmol de substrat
ZAR (N-Cbz-Ala-Arg) par minute dans le standard de mesure à 80°C.
| |PfuCP | |
|N-Cbz-alanyl-Arginine +|---------------------------|N-Cbz-alanine + Arginine|
|H2O |--------------> | |
| |tampon pH 6,5 + CoCl2 0,4 | |
| |mM |