Les Observations microscopiques

Les Observations microscopiques
(Etat frais et mobilité, colorations)
Etudier la morphologie microbienne, au microscope photonique, c'est
rechercher la forme des bactéries et leur mode de groupement. Ces renseignements peuvent être fournis par une simple préparation à l'état
frais entre lame et lamelle, les bactéries étant alors observées vivantes,
ou par l'observation d'un frottis coloré. Les examens microscopiques de prélèvements peuvent fournir des informations
très précieuses pour le diagnostic et le traitement d'une infection. Dans
tous les cas, ils orientent le diagnostic, le choix des milieux de culture
et les conditions d'incubation. A partir d'une souche pure, c'est le premier critère d'identification. Les examens microscopiques d'un prélèvement polymicrobien permettent enfin
de connaître les proportions de chaque sous-population dans le prélèvement.
I Observation à l'état frais
Une préparation à l'état frais permet d'examiner la mobilité des bactéries
et d'en déceler la forme, bien que ce renseignement soit plus accessible
sur des frottis colorés. Si la bactérie est sporulée, l'état frais permet
également de mettre ce phénomène en évidence. Pour observer la mobilité, on
doit prendre garde à ne pas détruire les flagelles bactériens lors du
prélèvement et de la préparation de la lame. Technique de la préparation de l'état frais Déposer une petite goutte d'eau stérile sur la lame.
Prélever une fraction de colonies sur gélose, de préférence aux bords de
celle-ci (ou prélever une petite goutte de bouillon). Faire une suspension
homogène dans la goutte d'eau en incorporant progressivement l'inoculum et
en remuant très délicatement (afin de ne pas casser les flagelles).
Recouvrir d'une lamelle en évitant d'enfermer des bulles d'air. Le liquide
ne doit pas déborder (sinon jeter la lame dans une solution désinfectante
et recommencer).
Observer rapidement à l'objectif 40 en mettant la lumière au maximum mais
en fermant le diaphragme (ou utiliser un systéme « fond noir » ou à
« contraste de phase » ).
Après observation, jeter l'état frais dans un bac contenant un désinfectant
à large spectre car les bactéries sont vivantes... Veiller à observer une grande partie de la lame, mais ne pas prolonger
l'observation au-delà de 3 à 10 minutes. Ne pas hésiter à recommencer... Des bactéries sont considérées comme mobiles lorsque des trajets très
différents sont observés (déplacement dans toutes les directions). Une
bactérie immobile est animée de mouvements d'agitation normaux dits
mouvements browniens (agitation moléculaire), qu'il ne faut pas confondre
avec la mobilité. De plus, lors de la pose de la lamelle, des flux
liquidiens entraînent toutes les bactéries dans le même sens et à la même
vitesse...
ATTENTION ! Une bactérie mobile peut apparaître immobile alors qu'elle est
flagellée si les conditions de l'observation ne sont pas optimales. Les
flagelles ne doivent pas être cassés par la préparation ou détruit par un
instrument trop chaud ; la bactérie doit provenir d'une culture jeune. La
température de l'incubation peut aussi avoir de l'influence : certaines
bactéries immobiles à 37°C sont mobiles à 22°C (Yersinia, Hafnia par
exemple). Il est possible de confirmer la mobilité par l'ensemencement
d'une gélose molle ou par la coloration des cils
II Observation d'un frottis coloré 1- Réalisation d'un frottis Avant toute coloration, il faut réaliser un frottis, c'est-à-dire un
étalement, si possible monocouche, des bactéries sur une lame. La technique du frottis est fort simple : Déposer sur une lame propre une goutte d'eau stérile si la culture prélevée
est solide, puis prélever à l'aide de l'anse de platine une parcelle de la
culture. Mélanger afin d'obtenir une suspension homogène. Il est également
possible de déposer une goutte de milieu liquide incubé ou une goutte de
suspension.
Réaliser le frottis en partant du centre de la lame, en décrivant avec
l'anse des mouvements circulaires de façon à obtenir un étalement mince et
homogène sur au moins 2/3 de la lame.
Stériliser l'anse.
Sécher et fixer le frottis au-dessus de la flamme du bec Bunsen sans trop
le chauffer. La technique la plus sûre consiste à passer dans la flamme le
frottis 3 ou 4 fois une demi seconde, face sans bactéries vers la flamme.
Le frottis étant fixé, la lame ne présente plus de danger de contamination. On peut alors effectuer la coloration désirée. Remarque : avant de colorer, attendre que la lame refroidisse sous peine de
cristallisation du premier colorant ou de casse de la lame... 2- Technique générale d'une coloration Toutes les colorations en bactériologie suivent un même principe qui peut
se définir en 3 (éventuellement 4) étapes qui sont : - Etape de COLORATION (c'est le colorant qui donnera un résultat
positif à la fin)
- Une éventuelle étape de mordançage ou d'intensification de la
coloration
- Une étape de décoloration ou EPREUVE (c'est le caractère que l'ont
cherche à mettre en évidence)
- Une étape de CONTRE COLORATION qui permet d'observer les germes
décolorés précédemment (donc c'est le colorant donnant un résultat
négatif)
3- La coloration de Gram A- Principe La coloration de Gram est la base de l'identification d'une souche
bactérienne. Elle doit être parfaitement maîtrisée car c'est le point de
départ du choix des examens complémentaires à effectuer, des milieux à
ensemencer etc... Au terme du processus de coloration, les bactéries dites « Gram Négatives »
apparaissent roses tandis que les bactéries dites « Gram Positives » sont
colorés en bleu foncé/violet (rem : certaines bactéries telles que les
Bacillus, apparaissent parfois roses et violettes sur le même frottis, on
les dit « Gram labiles » et les différences de coloration sont dues à des
différences d'âge des bactéries) La coloration de Gram est une coloration qui teste l'alcoolo résistance
d'une souche bactérienne. En effet, les différences de coloration des
bactéries reposent sur des différences de constitution de la paroi : [pic][pic] Les bactéries Gram négatives ont une paroi plus fine que celles à Gram
positives. De plus, cette paroi est très riche en lipides (membrane externe
de la paroi) dans laquelle l'éthanol est fortement soluble...
B- Technique - Réaliser un frottis et le fixer.
- Coloration : violet de gentiane phéniqué durant une minute. Toutes les
bactéries prennent ce colorant et sont donc colorées en violet.
- rincer à l'eau du robinet
- Mordançage : recouvrir la lame de réactif de Lugol 1 minute (réactif
iodo-ioduré qui accentue la coloration).
- Rincer à l'eau
- Epreuve (alcoolo résistance) : Plonger 3 ou 4 fois une demi seconde
dans un pot d'alcool puis rincer à l'eau du robinet immédiatement.
Pendant cette étape, les lipides de la paroi des Gram moins sont
dissous et l'alcool peut donc pénétrer dans le corps bactérien et
expulser le violet de gentiane. Les bactéries Gram moins sont alcoolo-
sensibles et sont donc décolorées. La paroi des Gram plus ne laisse
pas passer l'alcool et sont dites alcoolo-résistantes et restent
colorées en violet.
- Contre coloration : Fuschine diluée au 1/20ème ou de safranine pendant
une minute. Toutes les bactéries prennent le colorant mais le violet
masque la fuschine. Les « Gram positives » apparaissent donc
violettes, les « Gram négatives », recolorées par la fuschine,
apparaissent roses.
- Rincer à l'eau du robinet et sécher entre deux feuilles de papier
absorbant.
- Observer à l'objectif 100 à immersion, à pleine lumière. Remarque : la coloration de Gram est parfois appelée coloration V.L.A.F
afin de se rappeler les colorants et dans quel ordre ils doivent être
utilisés ( Violet, Lugol, Alcool, Fuschine).
[pic] 4- La coloration de Giemsa
A- Principe La coloration de Giemsa est une coloration polychromatique douce. En effet,
le colorant de Giemsa contient 3 colorants (bleu de méthylène, azur de
méthylène et éosine, l'élément le plus important étant un composé qui se
forme spontanément dans le mélange : l'éosinate d'azur de méthyle) qui
donnent des colorations différentes selon le support où ils se fixent. En
bactériologie, cette coloration conservant mieux les cellules et étant
moins agressive que le Gram permet d'observer des bactéries fragiles, trop
radicalement altérées par une autre coloration : spirochètes, spirilles,
mycoplasmes etc. Par ailleurs, elle permet également de mettre en évidence
la capsule bactérienne ou les bactéries intracellulaires. B- Technique La technique décrite ci-après est dite « coloration lente de Giemsa ». La
solution de travail ne se conservant pas, il faut la préparer
extemporanément en diluant au dixième une solution mère (conservée à l'abri
de l'humidité et de la lumière) avec de l'eau tamponnée pH=7. Dans cette coloration, les étape de coloration, épreuve et contre
coloration sont toute faites simultanément lors de l'action du colorant de
Giemsa - Réaliser un frottis et le fixer de manière douce. Il est préférable de
la laisser sécher longtemps à l'étuve...
- Recouvrir de solution de Giemsa (diluée) et laisser colorer 30
minutes. On peut également utiliser une cuve à coloration.
- Eliminer le colorant et rincer à l'eau tamponnée. Rincer ensuite à
l'eau du robinet.
- Sé