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examen bactériologique des selles
par Catherine Dupeyron Biologiste, Hôpital Albert-Chenevier, Créteil. L'examen bactériologique des selles se fait par coproculture, c'est-à-dire
par ensemencement des selles sur des milieux de culture appropriés. Le but
est de rechercher parmi une flore commensale très abondante soit des
bactéries habituellement absentes et réputées pour leur pouvoir pathogène,
soit une espèce bactérienne anormalement prédominante. Les indications de la coproculture sont triples : - la recherche de la cause infectieuse d'une diarrhée, qui est la plus
fréquente, - le dépistage des porteurs sains pour les métiers de l'alimentation, - les enquêtes épidémiologiques. Dans le cas des diarrhées infectieuses, les bactéries à rechercher
systématiquement sont Salmonella, Shigella, Campylobacter (et Yersinia dans
les pays industrialisés). Vibrio cholerae est le plus souvent recherché dans un contexte clinique
particulier ou sur une demande spécifique. Les Escherichia coli pathogènes
ne peuvent actuellement être totalement identifiés que dans des centres
spécialisés (Instituts Pasteur). Clostridium difficile est recherché dans
les diarrhées aiguës consécutives à une antibiothérapie importante.
1. Prélèvement - Une noix de selles, dans un récipient stérile. - Examen dans les 4 heures (conservation maximale 8 heures à 4°C).
2. Fiche de renseignements cliniques Elle est demandée dans les pays industrialisés de façon à orienter
judicieusement les recherches en fonction des renseignements suivants - Âge.
- Signes cliniques : fièvre, douleurs, vomissements.
- Origine géographique ou voyage récent.
- Antibiothérapie.
- Cas de diarrhée dans l'entourage. Elle est plus difficile à obtenir dans les pays en développement, mais une
fiche même succincte est utile.
3. Examen macroscopique - Noter l'aspect de la selle : purulent, présence de mucus, présence de
sang.
- Sa consistance : liquide, molle, moulée.
4. Examen microscopique Pour les selles liquides, on travaillera directement sur la selle. Pour les selles moulées, il faudra faire une suspension à 10 % dans du
soluté de NaCI à 9 P. 1000. . Observer les selles à l'état frais (entre lame et lamelle) et noter la
présence de : - leucocytes ;
- hématies ;
- bactéries très mobiles (Vibrio). . Observation des selles après coloration de Gram : - évaluer le pourcentage de bactéries Gram + et Gram -;
- rechercher les aspects caractéristiques (Campylobacter, Vibrio). Cet examen est très important et ne doit jamais être omis. Il permet de
rechercher les leucocytes qui, en quantité supérieure à 5 par champ, sont
le signe d'une diarrhée à germe invasif, de même que la présence
d'hématies. Il permet de voir aussi si la flore est équilibrée entre
bactéries à Gram positif et à Gram négatif (environ 60 % de bactéries Gram
-, et 40 % de bactéries Gram +, dans une selle normale). 5. Ensemencement, identification Salmonella - Shigella
. Milieux d'isolement Des milieux solides d'isolement pour entérobactéries doivent être
ensemencés, soit le milieu Salmonella - Shigella (SS) soit le milieu
Hektoen. Le milieu Hektoen est recommandé car il est mieux adapté à la
culture des Shigella et plus discriminant. Ces milieux contiennent des
inhibiteurs des bactéries à Gram positif et des Proteus. Ils contiennent
aussi des sucres et des indicateurs colorés d'acidification, permettant une
orientation sur la nature des bactéries en fonction de leurs capacités à
métaboliser ces sucres. . Milieux d'enrichissement En même temps, pour les Salmonelles, un enrichissement doit être effectué
dans un milieu liquide contenant des inhibiteurs des autres
entérobactéries. Les deux milieux les plus utilisés sont le milieu de
Muller Kauffmann qui contient des sels biliaires, du tétrathionate et du
vert brillant, ou le milieu de Leifson qui contient du sélénite de sodium.
Après 24 heures, le contenu de ce milieu est repiqué sur gélose Hektoen. L'incubation de tous les milieux se fait à 37° C pendant 18 à 24 heures. Les milieux Hektoen ou SS doivent ensuite être observés avec attention et
les colonies suspectes (tableau n° 1), 5 au moins, doivent être repiquées
sur des milieux urée indole. Une urée positive permet d'éliminer les colonies de Proteus. Les milieux
où la réaction urée reste négative doivent être ensemencés sur des galeries
d'identification (milieux Kligler, mannitol, citrate, etc. ou galeries API
ou autres) (tableaux n° 2, 3 et 4). Au cas où le diagnostic biochimique conduit à l'identification de
Salmonella ou de Shigella, il doit être confirmé par l'identification
antigénique. . Identification antigénique Pour les Salmonella qui comportent plus de 2000 sérotypes, on peut utiliser
les sérums OMA et OMB qui sont des mélanges d'agglutinines anti 0 des
principaux groupes rencontrés en pathologie humaine. Si le laboratoire en
a les moyenne l'identification est poursuivie avec les sérums anti 0
monovalents. Pour cette partie du diagnostic qui demande à être détaillée,
nous renvoyons le lecteur aux manuels de microbiologie. Pour les Shigella, il existe quatre sérums pour l'identification
antigénique : Sous-groupe A (S. dysenteriae)
- sérum A1 anti 1, 3, 4, 5, 6 (indole -)
- sérum A2 anti 2, 7, 8 (indole +)
Sous-groupe B (S. flexneri)
- sérum anti Shigella flexneri 6 sérotypes
Sous-groupe C (S. boydii)
- sérum C1 anti 1, 2, 3, 4 (indole -)
- sérum C2 anti 8, 10, 14 (indole -)
- sérum C3 anti 5, 7, 9, 11, 15 (indole +) [pic] [pic]
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Sous-groupe D (S. sonnei)
- sérum D Dans de nombreux pays, les souches de Salmonella et Shigella isolées
doivent être adressées à un Centre de Référence, qui collecte les données
épidémiologiques (Institut Pasteur).
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Campylobacter jejuni L'ensemencement se fait sur des milieux contenant des antibiotiques pour
inhiber la plupart des bactéries de la flore intestinale. Le plus courant
est le milieu de Skirrow contenant Vancomycine, Polymyxine et
Triméthoprime. L'incubation a lieu à 42° C en atmosphère microaérophile (correspondant au
mélange oxygène 5 %, gaz carbonique 10 %, azote 85 %). Cette atmosphère
peut être obtenue de façon simple avec des sachets à réhydrater
extemporanément : Anaerocult C mini, (Merck) ou en jarre anaérobie
(Campypack biomérieux, ou Gaspak anaérobie biomérieux sans catalyseur) ou
autres réactifs du même type. L'incubation doit durer 48 heures pour obtenir des colonies visibles. Les
colonies sont petites, brunâtres, elles peuvent être muqueuses ou en voile. C. jejuni est un petit bacille Gram négatif fin, spiralé, très mobile avec
des formes en S, en longues spires ou en vol de mouettes. Il est catalase
+ et oxydase +. Il hydrolyse l'hippurate et est sensible à la céfalotine et
l'acide nalidixique. L'identification se fait par les caractères
biochimiques (tableau n° 5). Yersinia enterocolitica Ces bactéries peuvent être isolées sur milieu Hektoen si on les observe
après 48 heures. Les colonies sont petites, de diamètre < 1 mm. Il est
mieux d'utiliser un milieu sélectif, le milieu de Schieman, contenant de la
Cefsulodine, de la Novobiocine et de l'Irgasan. Après 24 heures
d'incubation à 30° C, les colonies sont rouge sombre, d'un diamètre < 2 mm.
L'identification biochimique est nécessaire car d'autres bactéries peuvent
se développer avec des colonies un peu plus grosses mais d'aspect voisin.
Elle peut se faire en galerie Api 20E (tableau n° 6). Vibrio cholerae Dans les cas de choléra, l'examen direct montre une flore constituée
uniquement de vibrions. Pour la recherche de porteurs sains, l'examen
direct n'est pas nécessaire.
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[pic] . Enrichissement : L'ensemencement se fait à partir des selles : un tube
d'eau peptonée alcaline et un tube d'eau peptonée alcaline salée sont
utilisés comme milieux d'enrichissement. Il faut ensuite incuber pendant
3 à 6 heures à 37° C, puis prélever une dose de la culture en surface et
ensemencer un second tube d'eau peptonée alcaline salée ou non, ainsi
qu'un milieu sélectif gélosé TCBS (thiosulfatecitrate-bile-sucrose-agar)
et les incuber une nuit à 35° C. On doit ensemencer également avec les selles un milieu gélosé TCBS et
l'incuber une nuit à 35° C. Sur gélose TCBS, les colonies de Vibrio cholerae sont jaunes, plates, de 2
à 3 mm de diamètre, oxydase positive. L'identification est faite par les caractères biochimiques (galerie API 20
E ou autre) Tableau n° 7, et par agglutination avec les sérums anti-Vibrio
cholerae anti 01 et anti 0139, à partir de colonies repiquées sur gélose
nutritive. Pour la détermination de la sensibilité au composé vibriostatique 0/129,
ensemencer un milieu gélosé Mueller-Hinton sur toute la surface de la boîte
et déposer un disque de composé. Après 24 heures à 37° C la crois sance de
Vibrio cholerae est inhibée (diamètre > 15 mm).
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Escherichia coli Escherichia coli comme toutes les entérobactéries ne présente pas
d'exigences particulières de culture. Il se développe sur les milieux SS
et Hektoen. Pour l'isolement à partir d'une selle, des milieux peu
inhibiteurs comme la gélose Mac Conkey (biomérieux) ou la gélose Drigalski
(Pasteur diagnostics) sont recommandés. L'identification repose sur les
tests biochimiques classiques (tableau n° 4). Une diarrhée à E. coli pathogène sera soupçonnée devant une se